常见问题解答
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Q:
荧光定量PCR结果，Ct>35，熔解曲线Tm值<80°C是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：
1.引物二聚体
2.未使用热启动的Taq酶或热启动Taq酶封闭效果不佳
解决办法：
1.重新设计引物或者选择产生最小信号的熔解温度峰的引物组合
2.使用热启动Taq酶或更换试剂厂家 -
Q:
荧光定量PCR结果，Ct<35，熔解曲线Tm值与目的基因一致是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：
反应体系污染模板
解决办法：
1.设置不同操作区域，如样品制备区、加样区和反应扩增区，避免不同步骤之间交叉污染；
2.反应体系在超净工作台内配制，使用带滤芯吸头；
3.将引物、水、试剂分装成小份，避免反复开启导致污染。 -
Q:
荧光定量PCR结果，熔解曲线Tm值80℃之后且比目的基因高是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：RNA含有gDNA污染。
解决办法：使用含有gDNA去除的反转录试剂盒。 -
Q:
荧光定量PCR结果，熔解曲线双峰，杂峰Tm在80℃之前是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：
1.存在引物二聚体；
2.模板量过低。
解决办法：
1.建议降低引物浓度或重新设计引物；
2.提高模板量。 -
Q:
荧光定量PCR结果，熔解曲线双峰，杂峰Tm在80℃之后是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：
1.存在非特异性扩增
2.gDNA污染
解决办法：
1.重新设计引物或者优化扩增程序，使用两步法程序或提高退火温度
2.可通过NRT样本确认 -
Q:
荧光定量PCR结果，熔解曲线单峰但不尖锐是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：存在大小相近的非特异性产物
解决办法：可通过高1.5%~2%琼脂糖电泳确认 -
Q:
荧光定量PCR结果，熔解曲线前端起杂峰是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：ROX浓度与机型不匹配；
解决办法：可在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看熔解曲线是否恢复正常。 -
Q:
荧光定量PCR结果，两种试剂平行对比，熔解曲线不一样是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：存在大小相近的非特异性产物；
解决办法：可通过高1.5%~2%琼脂糖电泳确认。 -
Q:
荧光定量PCR结果，熔解曲线单峰Tm值在80°C以前是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：未加模板，仅有引物二聚体的扩增；
解决办法：可通过电泳确认或者重复实验。 -
Q:
荧光定量PCR结果，有扩增曲线，无熔解曲线是什么原因？有什么解决办法？
A:可能原因：未设置熔解曲线，或者熔解曲线未设置信号采集；
解决办法：重新实验，增加熔解曲线阶段信号采集。
