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  无细胞试剂盒阳性质粒

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  无细胞蛋白质合成试剂盒技术手册

相关问答

• Q:

  F1：使用本品表达其他蛋白，是不是根据提供的质粒骨架进行替换 superfolder GFP 的CDS区域即可？

  A:

  表达其他蛋白时，只替换superfolder GFP会残留N端的标签，如果不需要标签替换从ATG到TAA整个翻译区。

• Q:

  F2：质粒骨架的 T7 启动子→T7 终止子以外的质粒骨架序列是否可以替换？还是必须用您这边的骨架序列？

  A:

  可以，例如pET9a、pET23a等质粒也可以，重点是T7启动子到T7终止子序列不建议替换，质粒骨架可以换。

• Q:

  F3：T7 promoter后面到蛋白的CDS区域之间的 5’UTR序列是否是您这边经过优化的？未进行标注的关键区域是否可以再进行序列优化和替换？

  A:

  5’UTR是优化的，不建议替换。T7启动子到T7终止子区域不建议替换，如果该区域有优化需求可自行尝试优化，其它区域都可以优化和替换。

• Q:

  F4：加入模板DNA的最低浓度是多少？是否DNA模板加入量和蛋白表达效率相关？

  A:

  模板DNA浓度低于4 ng/μl，会降低表达量。模板DNA加入量和蛋白表达量有关，建议根据蛋白优化，一般8 ng/μl左右就可以。

• Q:

  F5：相同模板的蛋白表达量组间差和批间差是否稳定，是否有相关数据？

  A:

  相同模板的蛋白表达量组间差和批次差相对稳定，偏差约10%~20%左右。

• Q:

  F6：无细胞表达与传统大肠杆菌表达的区别是什么？

  A:

  对比项	无细胞表达系统	传统细胞表达系统
  定义	无细胞蛋白表达属于体外反应系统，无需完整活细胞，直接利用细胞提取物（含核糖体、酶、tRNA、氨基酸等翻译所需成分），在体外环境中完成转录和翻译。	传统大肠杆菌表达依赖活的大肠杆菌细胞，通过将目的基因导入细胞，利用细胞自身的转录、翻译机制（体内环境）合成蛋白。
  实验流程	模版制备→无细胞反应	质粒构建→转化大肠杆菌→筛选阳性克隆→扩大培养→诱导表达→收集细胞→裂解纯化
  耗费时间	1~2 h 即可表达出目的蛋白，8~16 h 即可达到最大量	时间数天到数周
  特殊蛋白表达	可表达各种类型的蛋白，包括毒性蛋白、富含二硫键蛋白或难溶蛋白	毒性蛋白、富含二硫键蛋白或难溶蛋白表达困难
  操作便捷性	简单快捷，开盖即用，仅需加入 DNA 或 RNA 模板	对实验条件和操作技能要求高
  应用灵活性	可使用 96 孔板或离心管进行反应，高通量筛选；修饰等更灵活	难以实现高通量表达和筛选

• Q:

  F7：合成的蛋白质可以使用哪些方法纯化？

  A:

  可以使用镍磁珠纯化。

• Q:

  F8：是否需要在合成前纯化质粒或线性 DNA 模板？

  A:

  说明DNA的质量对无细胞很关键，可以使用高品质的质粒小量制备试剂盒或 PCR 和 DNA 纯化试剂盒。

• Q:

  F9：无细胞表达使用质粒模板和 PCR 线性 DNA 模板表达量会有区别吗？

  A:

  质粒模板比 PCR 线性 DNA 模板产量会高10~20%左右。

• Q:

  F10：无细胞表达可以使用mRNA模板进行反应吗？

  A:

  基于裂解液提取的无细胞表达不适用直接使用mRNA模板进行反应。

• Q:

  F11：大肠杆菌无细胞表达一定要用T7启动子吗？可以用其它启动子吗?

  A:

  是的，必须用T7启动子；其它启动子效率低，不推荐使用。

• Q:

  F12：大肠杆菌无细胞可以表达多大分子量蛋白

  A:

  一般可直接表达10~150kD分子量范围内蛋白。＜10kD蛋白需加融合标签（融合标签分子量建议≥10kD），后续可切除标签进行表达。

• Q:

  F13：无细胞反应过程需要摇晃吗？

  A:

  为保证氧气的供给，无细胞反应可以放置在可控温的摇床或者振荡器中，转速可以设置为200~250 rmp。

• Q:

  F14：无细胞可以同时表达来自不同质粒的不同蛋白吗？

  A:

  可以，单个反应中可以同时表达不同蛋白，但是产量相比单个蛋白表达可能会下降。

• Q:

  F15：无细胞表达反应结束后需要加多少纯化磁珠量？

  A:

  一般可按照离心后上清体积与磁珠体积2：1体积比加入。

• Q:

  F16：无细胞表达允许的最小反应体积是多少？

  A:

  测试最小反应体积为10μl，更小反应体积暂无数据。

• Q:

  F17：无细胞反应容器怎么选择？

  A:

  为保证氧气的供给，一般选择反应容器与反应体积至少10：1以上体积比的容器。

• Q:

  F18：阳性对照sfGFP的蛋白分子量大概是多少？

  A:

  约为33kD。

• Q:

  F19：无细胞表达反应产物如何检测？

  A:

  产物可以进行SDS-PAGE电泳检测；若蛋白表达量低，可以根据目的蛋白的特性选择合适的检测方法，如Western blot、Elisa、融合荧光蛋白检测荧光强度以及产物不干扰下游实验的情况下进行功能测试等。

• Q:

  F20：无细胞表达反应产物如何保存？

  A:

  反应结束后可以选择性加入蛋白酶抑制剂后暂存-20度保存，长时间保存需-80度保存；产物需避免反复冻融，如需多次冻融建议分装保存。

• Q:

  F21：无细胞表达阳性对照质粒反应液没有变绿是什么原因？有什么解决办法？

  A:

  1.试剂盒可能失活，将无细胞蛋白表达反应组分置于-80℃储存。为避免反复冻融，可根据反应用量，将A液和B液分别分装后用液氮速冻后再置于-80℃储存。
  2. 核酸酶污染，实验操作过程中请戴上手套和口罩，并使用不含核酸酶的水、枪头以及离心管。

• Q:

  F22：无细胞阳性对照有蛋白表达，目的蛋白产量低或无表达是什么原因？有什么解决办法？

  A:

  1. DNA模板制备影响，DNA模板制备过程中，需注意去除乙醇、RNase，推荐使用柱纯化法纯化DNA，最后洗脱步骤使用RNase-free的ddH2O；PCR制备的模板需注意是否有非特异性扩增，非特异性扩增影响表达产量。
  2. DNA模板添加量影响，DNA模板需精确定量，并考虑对添加量进行优化。
  3. 基因结构影响，确保目的基因上下游序列按照要求设计。
  4. DNA序列影响，确保序列阅读框没有移码；序列按照大肠杆菌密码子使用偏好进行密码子优化；添加或者更换融合标签种类与位置。

• Q:

  F23：无细胞目的蛋白有表达但是活性低或者无活性是什么原因？有什么解决办法？

  A:

  1. 折叠不正确，可以尝试使用较低温度（例如16℃）以及更长反应时间（例如24h）反应；或者选择添加折叠伴侣的Pro版和依赖二硫键折叠的Max版。
  2. 表达的目的蛋白需要进行翻译后修饰，大肠杆菌无细胞表达是原核生物表达系统，不含翻译后修饰功能，需要确保所表达的蛋白翻译后修饰不影响蛋白活性。
  3. 表达的目的蛋白需要辅因子才能具有完整的活性，可以尝试在反应过程中加入所需的辅助因子。

• Q:

  F24：无细胞目的蛋白有表达但是不可溶是什么原因？有什么解决办法？

  A:

  1. 折叠不正确，可以尝试使用较低温度（例如16℃）以及更长反应时间（例如24h）反应；或者选择添加折叠伴侣的Pro版和依赖二硫键折叠的Max版。
  2. DNA序列影响，序列按照大肠杆菌密码子使用偏好进行密码子优化。
  3. 蛋白序列可溶性差，尝试添加助溶标签提供可溶性或者不影响功能活性的情况下去掉蛋白疏水结构域。

• Q:

  F25：无细胞目的蛋白表达不是全长蛋白，有截短体蛋白，是什么原因？有什么解决办法？

  A:

  1. 标签位置不对，尝试更换标签位置（例如N端换成C端）。
  2. 标签与目的蛋白中间Linker过短，可以更换长柔性Linker序列。
  3. DNA序列内部存在核糖体结合位点或者形成发夹结构，建议重新优化DNA序列。

• Q:

  F26：如果需要表达膜蛋白应该如何选择无细胞表达试剂盒？

  A:

  膜蛋白表达可以选择Max版，反应体系需要筛选合适去垢剂以稳定蛋白。

• Q:

  F27：CFPS-Control Plasmid I和CFPS-Control Plasmid II质粒有什么区别？

  A:

  CFPS-Control Plasmid II 为VHH（纳米抗体）表达配套的阳性对照质粒，同时可用作通用克隆载体骨架，带StepII标签与GFP11标签（基于分裂GFP (split-GFP)技术的荧光检测标签）。