不建议直接用于电转化，需要将产物纯化后再用于电转，可以用柱纯化或者乙醇沉淀纯化。

载体必须线性化，环状载体无法用于DNA Assembly Mix系列克隆。线性化载体制备方法详见：熬过夜的分子实验人必看！Gibson无缝克隆实操干货

可以正常进行，DNA Assembly Mix Ultra（EG24204）可以允许同源臂之外不匹配序列长度在50 bp以内不影响同源重组效率，超过50 bp后同源重组效率会严重下降。测试数据详见：Gibson无缝克隆，你所不知道的

不同品牌的试剂盒虽然全部基于同源重组原理，但不同品牌对产品的优化方向不一致，包括酶的用量、缓冲液配方等，因此不推荐混用，防止实验失败。

(1)感受态效率低下：感受态细胞的转化效率至少需>10^7 CFU/μg。可进行简单检测，转化0.1 ng pUC19质粒，生长1000个菌落，估算转化效率为10^7 CFU/μg。当重组转化子 产物>10 kb以上时，推荐使用≥10^8  CFU/μg感受态细胞或者适用于大质粒DNA 和重组产物转化的感受态细胞。
(2)载体与片段摩尔比不佳或者载体加入量偏低：按照说明书推荐的最适用量和比例配制反应体系。载体和插入片段的浓度测定： 若线性化载体与插入片段已经过纯化，且经电泳检测条带单一或无Smear残留时，可使用超微量核酸蛋白检测仪等基于分光光度法的仪器进行浓度测定，但只有当A260/A280在1.8~2.0之间时浓度值可信；若线性化载体与插入片段未经过纯化，也可使用琼脂糖电泳估算样品浓度。
(3)DNA片段纯度不够：对载体和插入片段进行胶回收纯化。由于EDTA等金属离子螯合剂会抑制无缝克隆反应，因此纯化产物应溶解于ddH2O中，切勿使用Tris-EDTA等缓冲液。如果片段PCR产物未回收，其加样体积不应超过总反应体系的20%。
(4)反应产物过量：转化体系中，无缝克隆反应产物体积不应超过感受态细胞体积的10%
(5)插入片段编码产物对大肠杆菌有细胞或基因毒性：30℃低温培养。

(1)载体线性化不完全或者载体未纯化：可通过阴性对照检测载体是否线性化完全；酶切制备线性化载体时，提高快速内切酶的使用量，延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物。
(2)相同抗性质粒污染：以质粒为模板进行插入片段PCR扩增时，使用预线性化质粒作为扩增模板，降低PCR扩增中质粒模板的加入量并且对Dam于甲基化模板使用DpnI等甲基化敏感型内切酶对扩增产物进行处理，或对产物进行胶回收纯化。
(3)平板抗性不足：确保使用正确的抗生素，并使用新鲜制备的抗生素平板。

（1）插入了，但序列有随机突变：插入片段编码产物对大肠杆菌有细胞或基因毒性；建议30℃低温培养
（2）插入了，但方向反了：同源臂有反向互补序列，导致片段反向插入；建议检查同源臂序列，避免反向重复；设计引物时注意方向。
（3）有大小相似的非特异性扩增：菌落PCR引物非特异性扩增，看起来大小对，实则不是目标片段；建议用载体上的通用引物做菌落PCR；或直接提质粒酶切验证。

考虑基因内部有重复序列，同源臂配对时发生发生错位，产生缺失或重复；建议避开重复区域设计同源臂；或延长同源臂增加特异性；或者使用适合重复序列DNA片段克隆的感受态细胞；或者采用酶切连接、Golden Gate方法进行克隆。