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  SDS-CN-EG26502-LightNing® Bsu36I

相关问答

• Q:

  A1：为什么在CutOne® Buffer中加入HSA？

  A:

  一些酶在反应过程中需要HSA的参与，我们在CutOne® Buffer中添加了HSA，避免反应中额外添加组分，使得酶切反应更加便捷。

• Q:

  A2：HSA的添加对于雷霆系列限制性内切酶的功能会产生什么样的影响？

  A:

  在我们的测试中未曾发现HSA对于雷霆系列限制性内切酶的功能有任何影响。在有些情况下，对于部分的酶切反应有促进作用。

• Q:

  A3：为了保证酶量小于体系的1/10多酶切时往往可加入酶量较少，从而导致酶切不完全，如何解决？

  A:

  说明书中给出的是最佳反应体系，可以根据具体需求进行适当调整。

  酶切不完全的问题可以从这几个方面进行解决：降低底物浓度，提高酶量同时扩大反应体系，或者适当延长反应时间。

• Q:

  A4：我需要严格遵守5~15 min的酶切时间吗？能够延长反应时间吗？

  A:

  雷霆系列限制性内切酶经过改造可以将酶切时间缩短至5~15 min。同样也消除了限制性内切酶的星活性（长时间反应造成的非特异性消化），在说明书中告知的星活性出现的时间范围内可以适当延长反应时间。

• Q:

  A5：酶切反应完成后终止反应是不是必要的？我该如何终止我的酶切反应

  A:

  限制性内切酶对于下游反应（连接与转化等）有影响，部分限制性内切酶能与双链DNA结合，对于凝胶电泳会产生影响；而且不失活酶切产物不能保存。故反应完成后应对其进行失活处理。常规失活方式为高温热失活，对应各个限制性内切酶的失活温度请查阅说明书。另，部分上样染料中含有SDS可使蛋白变性，苯酚或氯仿的萃取也能使反应终止。

• Q:

  A6：我什么时候应当考虑星活性对于酶切反应的影响？

  A:

  如果额外的酶切条带对于实验结果会产生影响时我们应当考虑星活性对于酶切反应的影响。例如：进行基因型、突变型分析或克隆时我们应当避免星活性的产生。避免星活性的有效方法：适当扩大反应体积（较小的反应体积容易造成甘油体积达到或超过总反应体积的5%）；不进行超长时间孵育（过夜消化极易产生星活性）。

• Q:

  A7：酶切反应的具体操作流程是怎样的？

  A:

  大部分的科研工作者通常遵循如下流程：1 U限制性内切酶可以完全酶切1μg经过纯化的DNA，总体积为20 μl于1×CutOneTM Buffer环境下进行反应。为防止总酶量超过总体积的10%，在双酶切时可以适当扩大反应体系。千万不要孵育超过星活性出现的时间（星活性出现时间请查阅各酶说明书）。另外一个容易被忽略的问题对于酶切的影响也非常大，在反应体系配制完成后完全的混匀才能反应完全，推荐用枪头轻轻吹打3到5次或用手指轻弹管壁，之后用离心机瞬离即可。不要涡旋反应体系，剧烈震荡对酶的活性有极大的影响。

• Q:

  A8：酶切反应完成后，没有看到切割后的迹象，有哪些因素可能对酶切产生抑制作用？

  A:

  作为酶切反应底物的DNA应该是纯净的没有污染的，其中例如：苯酚、氯仿、酒精、EDTA、去污剂、过量的盐都会抑制酶切反应。部分酶对于DNA的二级结构较为敏感，DNA的缺刻、超螺旋都会对反应产生影响。另外很多限制性内切酶对于DNA的甲基化非常敏感，确保DNA的甲基化类型不会阻止限制性内切酶的反应。如果找不到您的酶切反应不能进行的原因，我们推荐对照DNA底物（有多个酶切位点的DNA底物例如lambda DNA），进行对比反应。如果对照DNA底物能够被切开而您的底物仍旧不能被切开，将两种DNA底物进行混合，进一步确保DNA底物中不存在能够抑制限制性内切酶反应的物质。

• Q:

  A9：超长时间的孵育（孵育时间超过1 h）对于酶切是否存在影响？

  A:

  雷霆系列限制性内切酶的酶活定义是以15 min反应时间为标准的。增加反应时间应该对应着减少酶的用量，值得注意的是不同的DNA底物对于酶的需求量是不一样的。为了使DNA底物反应完全同时避免非特异切割，使用前一定要仔细查阅酶的反应浓度、反应温度、反应时间、星活性出现时间等。

• Q:

  A10：限制性内切酶简并性识别位点一定是回文的吗？

  A:

  大多数二型限制性内切酶的识别序列是回文的，而且是特定的碱基序列。然而有些限制性内切酶具有简并性识别位点，也就是说识别位点中有一个或以上的碱基对是非特异的（例如：BsrfI识别5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。对于这样的具有简并性识别位点的限制性内切酶，只要是符合要求的序列皆能被识别并且被正确地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中两个并不是回文的，仍然能被BsrFI识别并且切割）。

• Q:

  A11：雷霆系列限制性内切酶的稳定性如何？运输过程中冻融会对酶的活力产生影响吗？

  A:

  运输过程中以干冰保持低温运输，酶有结冰的可能，但是这对于雷霆系列的限制性内切酶的质量没有影响，我们对所有的酶都进行了至少三次的冻融实验，检测结果表示，酶的活性仍旧是100%。您收到的酶可能是冰袋运输的，请不要担心，这仅仅是由当地的经销商运到您的实验室过程中采取的运输方案，我们经过严格的检测，暴露在4℃下经过24~48 h后仍然不受影响。

• Q:

  A12：除了高温还有什么方法能够让雷霆系列限制性内切酶失活？（也不想用苯酚或氯仿）

  A:

  可以使用EDTA终止反应，或者以SDS等蛋白质变性剂使得酶变性。如果酶切产物还要用于下游实验那么可以用胶回收试剂盒进行DNA清洁，回收后酶切反应就被终止了。

• Q:

  A13：酶切反应完成后跑凝胶电泳，结果条带与预期不符，可能原因有哪些？

  A:

  可能原因有如下几个：

  　　•　限制性内切酶表现出星活性：确保酶切反应是严格按照说明书推荐的步骤进行的。如果是由星活性引起的那么有以下几个解决方法：①减少反应时间；②增加反应体系的体积；③减少反应中酶的含量。

  　　•　酶切不完全（一个或多个酶切位点有部分DNA底物未被切开），可以尝试加多酶量或者延长反应时间。如果上面的尝试不能很好地解决问题，请从DNA底物上寻找解决方案，DNA底物中是否含有酶切反应抑制剂，将DNA纯化后再进行反应；DNA是否被甲基化，胞内的甲基化系统能够使DNA的特定碱基发生甲基化，而这些甲基化的碱基对于酶切反应有着不同程度的抑制。

  　　•　被未知限制性内切酶污染：未知的限制性内切酶可能通过不当的操作、不纯净的DNA底物、不洁净的管子等途径掺入酶切反应中。

• Q:

  A14：有哪些关键因素会导致星活性？

  A:

  长时间孵育、过量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、较小的反应体系等因素都会导致星活性的产生。

• Q:

  A15：未经纯化的PCR产物直接酶切要怎样设定体系？

  A:

  反应体系推荐由这些内容组成：10 μl PCR产物、2 μl 10× CutOne® Buffer、1~2 μl相应的限制性内切酶、ddH₂O补齐到30 μl。酶的用量根据PCR产物的浓度而定，只加入2 μl反应缓冲液的原因是PCR反应中存在对应的盐离子和金属离子，适当减少反应缓冲液的用量以保证最终反应体系中的环境适宜限制性内切酶发挥功能。

• Q:

  A16：雷霆系列限制性内切酶的活力定义是怎样的？

  A:

  雷霆系列限制性内切酶1 U的定义是正好在15 min于20 μl的反应总体系中将1 μg的 DNA底物在1×反应缓冲液的环境中完全消化所需求的酶量。

• Q:

  A17：雷霆系列限制性内切酶的活力单位与Thermo Fisher的活力单位或者 NEB的活力单位应该如何换算？

  A:

  由于反应时间，反应体系不同，活力单位无法直接换算。雷霆系列限制性内切酶活力单位是依据反应进行定义的，正好在15 min于20 μl的反应总体系中将1 μg的 DNA底物在1×反应缓冲液的环境中完全消化所需求的酶量为1 U，也就是说反应中加入与DNA底物成比例的酶量即可完成反应。

• Q:

  A18：目的基因进入细菌中，难道不会再次被限制酶切割吗？

  A:

  天然限制酶虽然来源于细菌，但同一种 (species) 细菌中，也只有部分基因型或血清型才含有限制酶。比如常见的EcoRI，虽然来源于大肠杆菌(E.coli)，但只有RY13这种菌株才含有EcoRI这种限制酶，而基因工程中常用的大肠杆菌菌株（比如DH5α、Top10、BL21等）是不含有EcoRI的。
  另一方面，用于基因工程的工程菌，除了自身不含有常用的Type II类限制酶（见限制酶种类知多少）之外，还会将比较广谱的Type I类限制酶基因也突变掉，确保细菌不会降解转化导入的外来DNA。

• Q:

  A19：目前很多生物试剂是由大肠杆菌生产的，如各种酶，这些生物试剂中有残留的大肠DNA，应该怎么解决呢？

  A:

  重组表达生产的酶制剂都会采取相应的纯化手段去除宿主蛋白和宿主DNA，根据产品用途不同，会制定相应的宿主DNA残留质量标准，正常情况下应该能通过产品COA查询。
  一般来说，只要是符合产品质量标准，残留的宿主DNA不会影响使用。但如果要检测大肠杆菌相关的样本，那么普通制剂就不行了，需要标准更高、残留更少的产品。
  另外，购买的成品试剂中酶的蛋白浓度都很低，自行纯化或者处理意义不大，还容易引入新的污染。

• Q:

  A20：同尾酶能不能防止目的基因和载体的任意连接？如何防止？

  A:

  使用同尾酶分别切割载体和目的片段本质上还是单酶切，载体确实有自连的可能性。一般来说还需要在酶切后使用碱性磷酸酶，将载体的5'端去磷酸化，使5'末端变成羟基。去磷酸化处理后的载体5'-OH和3'-OH不能连接，而目的基因两条链各自的5'端还有磷酸基团，能够在连接酶的作用下与载体的3'-OH之间形成磷酸二酯键。这样连接后双链上各自还有一个缺口，转入大肠杆菌后会在细胞内被修复完整。
  请注意，同尾酶切割后的连接效率偏低，实际工作中除非是实在找不到合适的双酶切位点，才会使用同尾酶。比如题主贴的这样图里，如果不是载体上有两个HindIII位点，其实用HindIII和Sau3AI做双酶切是最稳妥的。

• Q:

  A21：质粒线性化的目的是什么？

  A:

  质粒线性化是分子生物学中常见的操作之一，它的主要目的是为了使质粒更容易被转化进入宿主细胞中。质粒是一种环状DNA分子，通常在宿主细胞内复制，但是在某些情况下，质粒可能会变成线性分子。线性化质粒的过程可以通过限制性酶切来实现，即将质粒切开成线性分子的过程。
  质粒线性化的主要优点包括：
  1. 更容易被转化：线性化质粒的转化效率比环状质粒高得多。这是因为线性分子更容易与宿主细胞的表面受体结合，从而更容易被导入到细胞中。
  2. 增加克隆的稳定性：线性化质粒可以减少克隆的环化倾向，从而提高克隆的稳定性。这对于那些需要维持单一拷贝插入的基因来说尤为重要。
  3. 更容易进行序列分析：线性化质粒可以更容易地确定克隆的序列，因为它们不需要进行 circularization 反应。
  在进行质粒线性化时，有一些注意事项：
  1. 确认限制性酶切位点：限制性酶切位点必须存在于质粒图谱中，并且必须与所需切点邻近。
  2. 确认限制性酶的缓冲液和底物：限制性酶必须在正确的缓冲液和底物条件下进行反应。
  3. 进行高效的酶切反应：为了获得高效的酶切反应，必须添加足量的限制性酶和正确的反应条件（如温度和时间）。
  4. 确认线性化产物的大小：通过凝胶电泳分析确认线性化产物的大小是否正确。
  5. 确保试剂的质量：必须使用高质量的试剂来进行限制性酶切反应，以确保得到正确的结果。
  总之，质粒线性化是一种常见的分子生物学操作，可以提高转化效率和克隆的稳定性，并且更容易进行序列分析。在进行质粒线性化时，必须注意限制性酶切位点、缓冲液和底物、高效的酶切反应以及线性化产物的质量。

• Q:

  A22：胶中条带与预期不符的原因有哪些？有什么解决方法？

  A:

  原因（1）出现星号活性。解决方法：
  • 使用随酶提供的推荐缓冲液；
  • 酶切时间缩短至 5~15 min；
  • 适当扩大反应体积（较小的反应体积容易造成甘油体积达到或超过总反应体积的 5%）；
  • 不进行超长时间孵育（过夜消化极易产生星活性）；
  • 减少反应中酶的含量；
  • 降低甘油含量（通常不高于 5%）。
  原因（2）如果胶中出现比预期更大的条带，这可能是由于酶与底物结合。解决方法：
  • 降低使用的酶量；
  • 在上样缓冲液中加入 SDS（0.1~0.5%）以分离与 DNA 结合的酶。
  原因（3）限制酶切割不完全。解决方法：详见：酶切不完全可能的原因有哪些？有什么解决方法？
  原因（4）被未知限制酶污染。解决方法：不洁净的管子等途径掺入酶切反应中，此时应更换未开封的新酶。

• Q:

  A23：酶切反应时需要注意哪些问题？

  A:

  • 酶从冰箱取出后请一直置于冰上。
  • 注意反应缓冲液的终浓度为 1×。
  • 酶最后加入到反应体系中。
  • 加入酶之后将反应混合液混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心
  机中瞬时离心。切忌振荡混匀。
  • 避免 DNA 样品中酚、氯仿、乙醇、EDTA、去垢剂或过多盐离子的污染。
  • 注意底物 DNA 甲基化对所用限制酶的影响。
  • 加入酶液不应超过总体积的 10%，以避免甘油过量引起的星号活性。
  • 大多数限制酶建议保存在 -20℃，少数建议保存在 -80℃，具体参见说明书。
  • 如果您使用的是愚公缓冲液，10× CutOne® 缓冲液应保存在 -20℃。
  • 应在保质期内使用。

• Q:

  A24：什么是归位内切酶？

  A:

  归位内切酶是双链 DNA 核酸酶，能识别较长的非回文序列 (12~40 bp)。归位内切酶与限制性内切酶不同，没有严格的识别序列。因此，单碱基的改变并不影响其识别功能，但会不同程度地降低其切割速率。

• Q:

  A25：什么是切刻内切酶？

  A:

  一般情况下，限制酶都是同时切割 DNA 的两条链。但一些特殊的限制酶识别特定的双链序列，只切割双链 DNA 中的一条链，形成切刻（nicking） 状态的DNA 产物。切割产生的单链 5' 磷酸和 3' 羟基末端，可作为很多后续反应的底物，如 DNA 合成置换、链置换扩增、外切降解等。
  切刻限制酶的使用方法和普通限制酶一样。由于切刻产物没有完全断裂，因此检测切刻酶活性时，大多检测将超螺旋质粒底物转化为开环状态的能力。

• Q:

  A26：什么是限制性内切酶？

  A:

  限制性内切酶 （Restriction endonuclease or restriction enzyme） 是一大类可以识别特定核苷酸序列并水解特定位点磷酸二酯键，并产生游离 5' 磷酸和 3' 羟基末端的酶类统称，简称为限制酶或内切酶。限制酶来源于细菌的“限制 - 修饰”系统，最早发现于20世纪60年代末。1978 年，因发现并应用限制酶，Werner Arber、Daniel Nathans 和 Hamilton Smith 共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。

• Q:

  A27：什么是星号活性？导致星号活性的因素以及抑制方法有哪些？

  A:

  一、星号活性
  在非理想条件下，限制酶切割与理论切割位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号活性（Star Activity）。有研究者认为，星号活性可能是限制酶的一种内在性质，如果使酶暴露在特定极端反应条件下，所有限制酶都会出现星号活性。
  二、导致星号活性的因素
  • 较高的甘油浓度（>5% v/v）；
  • 酶与底物 DNA 比例过高；
  • 反应时间过长；
  • 低盐浓度（<25 mM）；
  • 高 pH 值（pH>8.0）；
  • 存在有机溶剂（如 DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等）；
  • 用其它二价离子替代镁离子（如 Mn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺ 等）；
  注：上述反应条件的改变对于每种酶的影响不同。
  三、抑制星号活性的方法
  • 尽量降低反应中的甘油浓度。限制酶一般贮存在 50% 甘油中，因此总酶量不应超过反应总体积的 10%；且尽量不要使用过小体积，以免反应过程中水分蒸发提高甘油浓度。
  • 选择能完全切割所需的最短时间，延长反应时间可能会引起星号活性。
  • 尽可能使用推荐缓冲液。不同离子浓度和 pH 值的缓冲液可能会引起星号活性。
  • 确保反应体系中不含其他有机溶剂，如制备 DNA 过程中可能会混有的乙醇。
  • 使用镁离子作为二价阳离子，其它二价阳离子不适合限制酶的活性位点，会对其正确识别造成干扰。

• Q:

  A28：限制酶反应时需要考虑星号活性吗？

  A:

  大多数星号活性是可以控制的，因此，做酶切反应时一般不需要考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提供的反应缓冲液，我司限制酶就不会出现星号活性。但是，在双酶切时一种酶的反应条件可能会引起另一种酶出现星号活性。
  避免星号活性的有效方法：适当扩大反应体积（较小的反应体积容易造成甘油体积达到或超过总反应体积的5%），避免超过 3 h 孵育。

• Q:

  A29：酶切不完全可能的原因有哪些？有什么解决方法？

  A:

  （1）加入酶量较少：我司说明书中给出的是最佳反应体系，可以根据具体需求进行适当调整。酶切不完全的问题可以从这几个方面进行解决：降低底物浓度，提高酶量同时扩大反应体系，或者适当延长反应时间。
  （2）酶切反应底物DNA 被污染：
  • 底物中含有过量的盐将抑制反应的发生，需进行 DNA 纯化 / 抽提后进行酶切反应；
  • 增大反应体系以稀释污染物，DNA 溶液体积不应超过总反应体积的 25%。
  （3）部分酶切割超螺旋困难：通常在标准反应体系中切割超螺旋 DNA 所需的酶量是切割 λDNA 的 3~5 倍，或者延长孵育时间。部分酶即使增加酶量或延时孵育也无法切割超螺旋，此时建议更换限制酶。此类酶常见的酶有NarI、BglI。
  （4）PCR 组份的抑制：PCR 产物酶切前尽量进行纯化，避免 PCR 产物中带入的其它物质影响酶切反应。通常建议 PCR 产物的添加量占总反应体积 25% 以下。
  （5）使用错误的缓冲液：应使用我司随酶提供的缓冲液。
  （6）温育时间过短：增加温育时间，但最长不建议超过 3 h。
  （7）位点切割缓慢：某些酶对一些特异性的位点表现出较慢的切割速度，如 KasI、NarI。可适当增加温育时间，一般1~2 小时即可。
  （8）需要两个识别位点：某些酶需要两个识别位点的存在才能有效切割，如BcgI、BpmI、FokI、NaeI、SacII、SfiI。若想使用此类酶切割单识别位点的底物，可尝试加入含识别位点的寡核苷酸。
  （9）未在反应体系配制完成后充分混匀：推荐用枪头轻轻吹打 3 到 5 次或用手指轻弹管壁，之后用离心机瞬离。
  （10）使用涡旋振荡器：不要涡旋混匀，剧烈振荡对酶的活性有极大的影响。
  （11）甲基化阻断：从细菌分离的 DNA 可能被 Dam 或 Dcm 甲基化修饰，从真核生物分离的 DNA 可能被 CpG 甲基化修饰。因此使用限制酶进行酶切前，应查看该酶的甲基化敏感性，确定该酶能否用于目标底物的酶切。如果酶被 Dam 或 Dcm 甲基化抑制活性，将质粒在dam-/dcm- 菌株中培养，或者更换非甲基化敏感型限制酶。此外 PCR 产物不存在甲基化，通常也可以解决该问题。
  （12）反应温度错误：部分酶的最佳反应温度不是 37℃，此类酶在 37℃一般活性较差，常见的有 BsmBI, 其最佳反应温度为 55℃。在 37℃仅有 10% 的活性。
  （13）没有识别位点：一些经过重组等处理的 DNA，碱基易发生缺失、变化等，建议确定 DNA 序列无变化。
  （14）缺乏保护碱基：通常限制酶发挥作用需要有一定的保护碱基，请于PCR 引物设计阶段注意添加。
  （15）找不到酶切反应不能进行的原因：推荐对照DNA底物（有多个酶切位点的DNA底物例如λDNA），进行对比反应。如果对照DNA底物能够被切开而您的底物仍旧不能被切开，将两种DNA底物进行混合，进一步确保DNA底物中不存在能够抑制限制酶反应的物质。

• Q:

  A30：酶切后弥散的原因？

  A:

  大概有以下两种原因，解决方法也附上，供您挑选使用：
  （1）原因：限制酶与底物DNA 结合。

  解决方法：
  • 降低使用的酶量；
  • 在上样缓冲液中加入 SDS（0.1~0.5%）以分离与 DNA 结合的酶，或使用 6× SDS DNA Loading Buffer；
  • 用蛋白酶 K 处理产物

  （2）原因：核酸酶污染。

  解决方法：
  • 使用新配制的无杂质的电泳缓冲液和新配制的琼脂糖凝胶；
  • 纯化 DNA。

• Q:

  A31：什么是甲基化？

  A:

  1.什么是甲基化？
  细胞中普遍存在各类甲基转移酶，能够将甲基供体上的甲基转移到腺嘌呤或胞嘧啶上，使 DNA 被甲基化修饰。而在体外通过 PCR 扩增获得的 DNA 片段则一般无甲基化修饰。甲基化修饰通常会导致对甲基化敏感的限制酶切割受影响或完全阻断。
  2.原核生物甲基化
  分 子 生 物 学 中 普 遍 使 用 的 部 分 大 肠 杆 菌 菌 株（ 如 JM109、HB101 等）还含有 4 种位点特异性的甲基转移酶，分别是：Dam 甲基转移酶（形成GmATC）、Dcm 甲 基 转 移 酶（ 形 成 CmCWGG）、EcoKI（形成 AmACNNNNNNGTGC和 GCmACNNNNNNGTT） 和 EcoBI（形成 TGmANNNNNNNNTGCT 和AGCmANNNNNNNNTCA），从这些菌株中提取的质粒 DNA 也会带有相应的甲基化位点。如果所使用的限制酶识别位点与这些甲基化位点有重叠，则可能导致酶切受到阻遏。例如，从基因型为dam+的大肠杆菌中提取的质粒不能被识别序列为 GATC 的DpnII 所切割。因此，对于受 dam 或 dcm 甲基化影响的限制酶，应当使用从dam-或dcm-基因型的大肠杆菌菌株中提取的 DNA，或使用 PCR 扩增获得的 DNA。
  3.CpG 甲基化
  哺乳动物细胞内普遍存在 CpG 甲基转移酶，会将一部分 CG 序列中的胞嘧啶进行甲基化修饰。如果限制酶酶切位点中包含 CG 序列，则酶切可能受阻。例如，HpaII 识别位点为 CCGG，无法切割被CpG甲基化修饰的 DNA。因此，在消化真核生物基因组 DNA 时，同样需要注意 CpG 甲基化的影响。注意，细菌一般不存在CpG甲基转移酶，因此被转化到细菌中扩繁得到的DNA，一般不存在CpG甲基化形式。

• Q:

  A32：限制性内切酶很少或没有克隆？

  A:

  原因（1）转化效率差。解决方法：验证您所用的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。
  原因（2）连接反应不成功。解决方法：
  • 确认载体或插入片段含有一个 5' 磷酸基团。
  • 可以尝试连接单酶切后的载体。
  • 确保用于制备载体和插入片段的限制酶已经通过酚抽提和缓冲液置换被去除，或者至少已经被灭活。
  原因（3）载体和 / 或插入片段的酶切不完全。解决方法：
  • 将酶切产物进行凝胶电泳来确认酶切状况。如果酶切不完全，则要进行重新酶切或凝胶纯化酶切完全的片段。
  • 如果通过 PCR 引物引入酶切位点。确保在酶切位点的上游有足够的保护核苷酸以实现有效的酶切（保护碱基的数目取决于所使用的限制酶。一般建议至少为 6 个碱基）。
  • 确保使用了正确的缓冲液用于酶切。
  原因（4）抗生素使用浓度过高。解决方法：确保使用了正确量的抗生素。
  原因（5）使用了错误的抗生素。解决方法：确保使用载体上带有的抗性基因对应的抗生素。
  原因（6）DNA 损伤或DNA 有切口。解决方法：在凝胶纯化过程中，尽可能减少 DNA 暴露于紫外光的时间。

• Q:

  A33：酶切反应时需要设置对照吗？

  A:

  最好设置对照，便于分析和鉴定酶切反应结果。特别是当酶切不成功时，便于查明原因。
  应设置阴性对照和阳性对照，具体为：
  1. 阳性对照，使用 λDNA 或其他已知质粒进行酶切，排除酶的质量问题；
  2. 阴性对照，反应体系不加酶，便于酶切以后的结果比对。

• Q:

  A34：特异性切割甲基化位点的限制酶有哪些？

  A:

  有少数限制酶识别并仅切割被甲基化修饰的 DNA，如 DpnI 和 SgeI。
  DpnI 特异性识别并切割双链 DNA 中腺嘌呤被甲基化修饰的 GmATC 序列（即Dam 修饰），对未被甲基化的 GATC 序列无作用。
  SgeI 特异性识别单链或双链 DNA 上胞嘧啶被甲基化的 mCNNG 序列（Dcm 修饰的一种）并在下游切割，不识别未被甲基化的 CNNG 序列。
  DpnI 和 SgeI 可以被用来进行 DNA 定点突变。从dam+ 或dcm+ 基因型菌株中提取的质粒带有甲基化修饰。如果设计带有突变位点的引物，以甲基化质粒为模板进行PCR 扩增，获得的产物不带有甲基化修饰。这样使用 DpnI 或 SgeI 进行处理，就会只消化未突变的质粒模板，而保留带有突变位点的扩增产物。

• Q:

  A35：限制酶消化的最佳 DNA 浓度是多少？

  A:

  限制性反应液中 DNA 浓度的最佳范围是 0.02~0.1 µg/µl。为了避免 DNA 溶液中潜在杂质的抑制，建议在 DNA 量较大时增加反应的总体积。

• Q:

  A36：限制酶简并性识别位点一定是回文的吗？

  A:

  有些限制酶具有简并性识别位点，也就是说识别位点中有一个或以上的碱基对是非特异的（例如：AccI 识别 GTMKAC，M=A/C，K=G/T）。对于这样的具有简并性识别位点的限制酶，只要是符合要求的序列皆能被识别并且被正确地切割（包括GTATAC，GTAGAC，GTCGAC 和 GTCTAC，其中两个并不是回文的，仍然能被AccI 识别并且切割）。

• Q:

  A37：什么是用于表观遗传研究的限制酶？

  A:

  有些同裂酶的甲基化敏感程度不同，对于甲基化和非甲基化位点能够产生截然不同的产物，可以有效获得甲基化信息。
  例如：
  DpnI 和 DpnII 可以用于分析 Dam 甲基化
  HpaII 和 MspI 可以用于分析 CpG 甲基化

• Q:

  A38：酶切反应完成后是否一定要终止反应？

  A:

  限制酶对于下游反应（连接与转化等）有影响，部分限制酶能与双链 DNA 结合，对于凝胶电泳会产生影响；而且不失活酶切产物不能保存。故反应完成后应对其进行失活处理。常规失活方式为高温热失活，对于无法热失活的限制酶，可以通过酚 / 氯仿抽提或 DNA 纯化试剂盒使反应终止。

• Q:

  A39：限制酶能切割单链DNA吗？

  A:

  从限制酶和双链DNA相互作用的几何结构来看，在分子水平上，限制酶几乎不可能识别并切开单链 DNA。
  而某些酶之所以可以切开单链DNA，很可能是因为这些酶识别了这些单链DNA上多个回文结构之间暂时形成的双链DNA。因此，单链DNA的切割受很多因素的影响，这些因素包括：DNA上识别位点的数目，这些位点之间的距离，瞬时二聚体的稳定性（富含 GC 的底物要比富含 AT 的单链 DNA 底物切割效率高）以及在识别位点之外有多少个保护碱基等等。

• Q:

  A40：什么是位点优势效应？

  A:

  某些限制酶对同一底物的不同位点切割效率不同，这种现象被称为位点优势效应(Site Preferences)。
  例如 NarI，它表现出明显的位点偏好性，在 pBR322 上 548 bp 位置的 NarI 位点处，酶切十分缓慢。

• Q:

  A41：切割超螺旋 DNA 应该注意什么问题？

  A:

  切割超螺旋所需酶量一般比切割线性 DNA 要多。通常在标准反应体系中切割超螺旋 DNA 所需的酶量是切割 λDNA 的 3~5 倍。

• Q:

  A42：什么是同裂酶？

  A:

  同裂酶（isoschizomer）：识别相同核苷酸序列的限制酶互为同裂酶，例如：BsmBI 与 Esp3I 均识别 CGTCTCNNNNN。对同裂酶的定义有两种观点：一种观点认为识别相同序列且在相同位置切割的酶才能称为同裂酶；另一种认为只要识别相同序列即为同裂酶，该观点认为下文提及的异裂酶也是同裂酶的一部分。同裂酶之间反应温度、反应缓冲液、甲基化敏感性、星号活性等可能不同，不能简单替换。

• Q:

  A43：底物 DNA 酶切后无变化，哪些因素可能抑制了酶切？

  A:

  • 底物中无所选限制酶的酶切位点，可能是由于序列突变或其他因素导致。
  • 很多限制酶对于 DNA 的甲基化非常敏感，应确保 DNA 的甲基化类型不会阻止限制酶反应。
  • 某些质粒提取试剂盒提取的底物带有杂质，会抑制酶切反应。
  • 部分酶需要 2 个及以上的识别位点才能进行切割，如 SfiI。

• Q:

  A44：假阳性过多的原因有哪些？有什么解决方法？

  A:

  原因（1）载体自连。
  解决方法：载体去磷酸化不彻底。通过对去磷酸化的载体连接和转化来验证。使用碱性磷酸酶对载体进行去磷酸化处理。
  原因（2）仍存在未被酶切的载体。
  解决方法：通过转化酶切后尚未进行连接的载体来验证。对酶切后的载体进行凝胶回收后再用于连接。
  原因（3）插入片段对细胞有毒性。
  解决方法：1. 尝试在较低温度（30℃或室温）培养细菌。克隆出现将需要更长时间。
  2. 尝试使用不同菌种。
  原因（4）使用的抗生素浓度过低。
  解决方法：使用正确浓度的抗生素。
  原因（5）抗生素发生降解。
  解决方法：使用无抗性的感受态细胞进行平板涂布，以确认抗生素筛选是正常工作的。

• Q:

  A45：我该如何建立一个限制酶酶切反应？

  A:

  大多数实验人员遵循的一般原则是10 U的限制性内切酶足以克服DNA来源、数量和纯度的不确定性。通常是在50 μl体系，适合的 1×反应缓冲液中，1 μg纯化的 DNA 中加入1 μl酶，，然后在推荐温度下孵育1小时。如果使用了过量的酶，为了省时，通常可以缩短孵育时长。
  为了保证反应体系中甘油浓度低于5%，以 50% 甘油形式提供的限制性内切酶不应超过总反应体积的 10%。
  一个成功的限制酶消化的一个极其重要但经常被忽视的因素是混合。反应必须充分混合才能实现完全消化。建议轻柔地上下吹打反应混合物或轻弹管壁。然后在微量离心机中瞬离。切勿涡旋，更多体系和限制酶反应的具体信息，请参阅对应每个限制酶的产品说明书。